6.5. Регуляция активности Cdk
Известно по крайней мере четыре механизма регуляции активности Cdk:
1. Первичный механизм активации - связывание с субъединицей циклина.
2. Полная активация Сdk путем фосфорилирования с помощью циклин активирующей киназы
CAK (cyclin activating kinase)
3. Ингибирование активной Cdk путем связывания с регуляторной субъединицей CKI
(cyclin kinase inhibitor).
4. Ингибирование Cdk фосфорилированием ингибирующего сайта.
Рассмотрим эти механизмы.
1.Связывание с циклином. По определению, активация Cdk требует его связывания с
циклином. На рис. 33 представлен такой комплекс. Ясно, что все Cdk не связывают все
циклины, так как в их взаимодействии есть значительная специфичность. Биохимические
свойства Cdk-циклин взаимодействия варьируют в различных комплексах. Некоторые
комплексы, как например циклин В - Cdk1, циклин А - Cdk2 и циклин Е - Cdk2,
взаимодействуют с высокой активностью в отсутствии каких-либо дополнительных
компонентов или модификаторов. Другие, например циклин А - Cdk2 и циклин Н - Cdk7, не
взаимодействуют до тех пор, пока субъединица Cdk не будет фосфорилирована по
треониновому остатку. В необычных случаях требуется третья субъединица - Mat1.
Рис. 33. Структура Cdk2-циклин А1-АТФ комплекса человека. Cdk2 расположена слева.
Циклин А - справа. Т-петля обозначена черной стрелкой. Связывание Cdk2 и циклина А
включает взаимодействие между спиралью PSTAIRE Cdk-2 и спиралями 3 и 5 циклина А, а
также между спиралью N циклина А и С-терминальной областью Cdk2. Связывание циклина
вызывает значительные конформационные изменения в Cdk2. Спираль 1.12 Т-петли
расположена в ?-цепи, позволяя спирали PSTAIRE двигаться вовнутрь, чтобы корректировать
расположение участка цепей, участвующих в ориентировке фосфата АТФ. Т-петля является
уплощенной относительно ее позиции в мономере.
2.Активирующее фосфорилирование Cdk. Связывание циклина А с Cdk2 увеличивает
киназную активность последней на несколько порядков. Это объясняется конформационными
измененими Cdk. В основном изменения касаются Т-петли Cdk. В несвязанном состоянии Т-
петля закрывает сайт связывания с белком-субстратом, что препятствует его
взаимодействию с АТФ. Кроме того, небольшая спираль на конце петли (Helix L12) вызывает
конформационные изменения АТФ-связывающего сайта, что не позволяет фосфату
ориентироваться правильно относительно белка субстрата (Рис. 33). Образование циклин-
киназного комплекса происходит благодаря взаимодействию спирали PSTAIRE киназы со
спиралями 3 и 5 циклина, а также С-концевой доли киназы и спирали N циклина. При этом
спираль L12 распрямляется и превращается в бета-складку, что позволяет спирали PSTAIRE
переместиться ближе к АТФ связывающему центру. Перемещение спирали PSTAIRE исправляет
конформацию АТФ - связывающего сайта, делая его активным, так как теперь фосфат
ориентирован правильно. Кроме того, Т-петля выравнивается, становясь плоской, и сайт
связывания с белком-субстратом становится доступным.
Дополнительное фосфорилирование треонина-161 Т-петли CAK (cyclin activating
kinase) приводит к дополнительной активации Cdk2 в 80-300 раз. Механизм этой активации
следующий: фосфат треонина-161 встроен в катионный карман под Т-петлей и действует как
центральный узел для сети водородных связей, стабилизирующих взаимодействие Cdk2 и
циклина А. При этом Т-петля выравнивается в одной плоскости еще сильнее и приближается
к циклину, что приводит к конформационным изменениям формы связывающего белок центра.
Других конформационных изменений не происходит. Следовательно, фосфорилирование Cdk
необходимо лишь для улучшения связывания с белковым субстратом.
К CAK (cyclin activating kinase) высших эукариот относится тримерный комплекс
Cdk7-циклин Н-Mat1. Он способен связываться с TFIIH - фактором репарации, а также
фактором транскрипции, участвующим в работе РНК полимеразы II. Активность Cdk7 не
является регулятором клеточного цикла у позвоночных.
3 Ингибиторы Cdk. Существует два основных семейства CKI (cyclin kinase
inhibitor) белков, осуществляющих ингибирование Cdk. Представители первого семейства
Cip/Kip (CDK inhibitory protein) - р21, р27 и р57, ингибируют Cdk2 и Cdk4/6 циклиновые
комплексы, осуществляя G1 и G1/S контроль. Представители второго семейства INK4
(inhipitor of kinase 4) - р15, р16, р18 и р19, узкоспецифичны для CDK4/6-цD комплексов
и осуществляют аналогичные функции.
Лучше всего изучена структура молекул семейства Cip/Kip. Эти белки содержат два
мотива: короткий мотив на N-конце для связывания с циклином и более сложный сегмент у С-
конца для связывания с CDK. Получена кристаллическая структура комплекса Cdk2-циклин А-
р27. Структура р27, связанного с комплексом Cdk2-цА, представлена на рис. 34. Малая
спираль на С-конце р27 помещается в центр связывания АТФ, чем и объясняется его
ингибирующая активность.
Рис. 34. Структура связи комплекса cdk2-циклин А1 с усеченным пептидом р27. Циклин А1
и cdk2 расположены как на рис. 33. Пептид р27 (затемнен) протянут через вершину
комплекса, причем N-конец связан с циклином А1, а С-концевая область на некотором
протяжении взаимодействует с субъединицей Сdk2, разрывая ?-складку малой доли и внедряя
малую спираль в АТФ-связывающий сайт. Сdk2 в этом комплексе фосфорилирована киназой
CAK по Thr160 Т-петли. Представленная структура иллюстрирует эффект фосфорилирования,
что приводит к дальнейшему сплющиванию Т-петли относительно ее позиции в
нефосфорилированном комплексе.
Последовательности, близкие к циклин связывающим мотивам для р21 и р27, были
найдены в факторе транскрипции E2F и pRb, которые взаимодействуют с циклином А. Таким
образом, Cip/Kip, по-видимлму, ингибируют фосфорилирование этих субстратов, конкурируя
с ними за связывание с циклином.
Как следует из функциональных особенностей CKI, их активация происходит, когда
дальнейшее продолжение клеточного цикла нежелательно. Так, например, лишение клеток
питательных веществ приводит к увеличению уровня р27, а внеклеточный ингибитор роста
TGF- вызывает увеличение уровня р15. Повреждения ДНК активирует транскрипцию р21 под
действием белка р53. Белок p21 способен ингибировать белок PCNA, принимающий участие в
репликации ДНК. Таким образом, осуществляется остановка клетки в сверочной точке G1
фазы, что позволяет клетке репарировать повреждения ДНК.
6.6. Ингибирующее фосфорилирование.
Cdk могут также ингибироваться фосфорилированием. Ингибиторное фосфорилирование
вносит вклад в отсчет времени митоза. До митоза комплекс циклин В-cdc2 (Cdk1)
инактивирован фосфорилированием по треонину-14 и тирозину-15. Фосфорилирование остатков
у позвоночных осуществляется Myt1 и Wee1 соответственно. К концу G2 резкое
дефосфорилирование этих двух остатков активирует cdc2 и запускает митоз.
Дефосфорилирование осуществляется фосфатазами семейства CDC25. Во время митоза Myt1,
Wee1 и CDC25 фосфорилированы. Это уменьшает активность Myt1, тогда как активность CDC25
увеличивается, что способствует активации cdc2. Интересно, что циклин В-cdc2 может
непосредственно активировать CDC25. Такая прямая обратная связь и обеспечивает резкое
дефосфорилирование. Кроме циклин В-cdc2 в фосфорилировании CDC25 принимают участие
представители семейства Polo киназ (Polo like kinase 1 - Plk1 у млекопитающих).
6.7. Регуляция циклинов
Регуляция циклинов осуществляется на двух уровнях: транскрипции генов и деградации
белка. Регуляция транскрипции генов циклинов у высших эукариот изучена на примере
перехода ограничительной точки клеточного цикла. Центральную роль в этом переходе
играет E2F, фактор транскрипции некоторых генов, необходимых для синтеза ДНК в S фазе.
Он стимулирует также транскрипцию генов циклина А, циклина Е и своего собственного
гена. Белок pRb ингибирует E2F, связываясь с последним в G1 фазе.
Факторы роста стимулируют транскрипцию циклина D через Ras-Raf-MAP сигнальный
каскад или под действием цАМФ. Происходит накопление комплексов циклин D-Cdk4, которые
начинают фосфорилировать Rb, что приводит к его диссоциации от E2F. Освободившийся E2F
стимулирует транскрипцию своего гена и гена циклина Е. Образующийся вследствие этого
комплекс CDK2-цЕ, еще активнее фосфорилирует pRb. Таким образом, сеть эффектов через
петлю положительной обратной связи приводит к быстрому возрастанию E2F зависимой
транскрипции и переходу клетки в начало S фазы. Вскоре после этого в клетке появляются
комплексы Cdk2-цА, которые фосфорилируют E2F, уменьшая его способность связываться с
ДНК.
Другим способом регуляции циклинов является их разрушение протеолизом. Таким
образом контролируется, например, выход из митоза. Деструкция митотических циклинов
необходима для начала телофазы и подготовки к следующему циклу. Возле N-конца
митотические циклины А и В несут небольшую последовательность, называемую боксом
деструкции. Эта последовательность необходима для конъюгации циклина с убиквитином,
который является маркером для узнавания циклина протеазой. Большая часть цитозольного
протеолиза осуществляется протеосомами. Протеосомы - это нелизосомальные
мультикаталитические протеиназы, обнаруженные у эукариот, широко распространенные в
цитоплазме. Они обладают 20S каталитическим ядром (М = 700 кд) которое осуществляет АТФ-
зависимую деградацию убиквитинированных белков. 20S протеосома состоит из 14
субъединиц, представляющих собой различные протеазы. Они образуют бочкообразную
структуру с активными центрами внутри. Большие протеазные комплексы, по крайней мере,
из десяти различных полипептидов образуют дно и крышку такой бочки. Из роль, видимо,
заключается в транспорте убиквитинированных белков в центр бочки.
Ключевым регуляторным компонентом в деструкции митотических циклинов является
мультисубъединичный комплекс APC (anaphase promoting complex) или циклосома. Этот
комплекс осуществляет присоединение убиквитина к циклинам и другим субстратам. Комплекс
имеет различную субстратную специфичность в переходе метафаза-анафаза и выходе из
митоза, так как связан в эти периоды с двумя различными регуляторными белками - Сdc20 и
Hct1 соответственно. Одним из субстратов ACP-Сdc20 является комплекс белков секурина и
сепарина, который удерживает вместе сестринские хроматиды хромосомы. APC-Сdc20
способствует разрушению секурина, под действием освободившегося сепарина сестринские
хроматиды расходятся, то есть осуществляется переход в анафазу. Комплекс APC-Hct1
осуществляет убиквитинирование циклина В. АСР активируется после длительного лаг-
периода посредством циклин А-Cdk2 и инактивируется под действием G1 циклинов.
Таким образом, молекулярные механизмы, которые запускают все события клеточного
цикла, должны работать по принципу "все или ничего", действуя необратимо и постоянно.
Клеточный цикл можно рассматривать как продукт программы резкого возрастания и падения
активности Cdk. Активация одного циклин-киназного комплекса должна быть не только
триггером событий клеточного цикла, но и должна инициировать активацию следующего
циклин-киназного комплекса. Таким образом, запрограммированная последовательность
передачи сигнала от одного комплекса к другому представляет собой часы клеточного цикла.
Классическим примером автономного колебания активности Cdk является колебание
активности комплекса циклин В-cdc2 (MPF) в раннем эмбрионе лягушки Xenopus. После
деструкции комплекса циклин А-cdc2 и выхода из S фазы постоянный синтез циклина В
приводит к его накоплению и, следовательно, образованию комплексов циклин В-cdc2.
Первоначально эти комплексы неактивны, так как они ингибированы фосфорилированием по
треонину-14 и тирозину-15 киназой Wee1. Однако по мере их накопления достигается порог
концентрации, при котором они могут фосфорилировать CDC25 и Wee1, вызывая
соответственно их активацию и ингибирование. Фосфорилированная CDC25 дефосфорилирует и
активирует циклин-киназный комплекс. Положительная обратная связь этих двух процессов
вызывает резкое возрастание киназной активности циклин В-cdc2. Повышенная киназная
активность вызывает переход клетки к митотическому статусу через фосфорилирование
различных клеточных субстратов. После слабо изученной лаг-фазы активированный циклин-
киназный комплекс инициирует деградацию циклина под действием убиквитин-зависимого
протеолиза. Разрушение циклина вызывает потерю киназной активности и выход из митоза.
Назад
Далее
Сайт управляется системой
uCoz