2.4. Методы тестирования биологических эффектов токсинов
Эпидемиологи делают выводы о причинах болезней из популяционных исследований. Для
токсикологов интересны индивидуальные исследования для выяснения механизма действия
конкретного агента. Напротив, молекулярные эпидемиологи проводят мониторинг окружающей
среды или используют биомаркеры. Примером этого могут быть анализ загрязнения воды,
выявление пестицидов в пище и молоке, токсины водорослей в рыбе, определение уровня ДНК-
аддуктов в тканях-мишенях. Потребность в таких измерениях высока и требует больших
возможностей. Традиционные аналитические методы являются дорогими и требуют
специального обучения. В ситуации, когда известен предполагаемый загрязнитель,
традиционными методы являются вполне подходящими. С другой стороны, для образцов, в
которых идентифицируется одно соединение или класс соединений, предпочтительными
являются иммунохимические методы. Они быстры, недороги, многие образцы можно
исследовать параллельно, и эти методы работают при минимальной подготовке. Пример этому
может быть тестирование беременности. Традиционный анализ ТХДД стоит 50$ по сравнению с
10$ иммунохимического метода.
Антитела. Критическими реагентами для иммунохимических методов
являются антитела. Среди 5-ти классов антител IgM обычно синтезируется первым в ответ
на антиген, затем он заменяется на IgG. Функции IgA схожи с IgG, но последний
присутствует в секреторных жидкостях, IgE опосредует гиперчувствительность реакций,
таких как сенная лихорадка и анафилактический шок. Функция IgD пока недостаточно
изучена.
В иммунохимическом анализе используются антитела, которые продуцируются в больших
количествах и присутствуют в плазме в значительных концентрациях (75% от общего
содержания антител). Эти антитела состоят из 4-х полипептидных цепей, две из которых
имеют м.м. 50 кД, а две других - 25 кД (вместе 150 кД). Они соединяются друг с другом
через бисульфидную связь. Это очень стабильные молекулы, что важно для их функций и
использования в иммунологических методах. Очень часто они представлены в виде Y-формы,
когда сайт распознавания антигена расположен на конце двух из 3-х рукавов. Таким
образом, IgG дивалентны, что позволяет им нековалентно и перекрестно связывать антигены
и образовывать иммунопреципитаты. Аминокислотная последовательность вблизи антиген
распознающего сайта называется вариабельной областью, так как она различается для
каждого специфического антитела, тогда как оставшаяся часть последовательности является
константной. Последняя весьма важна в регуляторной функции иммунного ответа. IgG
секретируются В-лимфоцитами в ответ на стимуляцию антигеном. Для образования антитела
на малую молекулу ее необходимо в качестве гаптена пришить с помощью химического
линкера на большую белковую молекулу-носитель. Когда такой поливалентный антиген
вводится животным (обычно кроликам), стимулируется образование большого количества В-
лимфоцитов с выходом антител. Каждый лимфоцит имеет на своей поверхности рецептор для
данного эпитопа (сайт распознавания антигена). По оценкам, можно получить до миллиона
эпитопов, так как В-лимфоциты проявляют широкий спектр рецепторов различной
специфичности. Когда данный лимфоцит стимулируется связыванием антигенного сайта
(эпитопа) со своим рецептором, это событие сопровождается секрецией большого количества
антител, которые распознают эпитоп. Обычно кроликам проводится инициирующая инъекция
антигена и одна или более разрешающих (усиливающих) инъекций. Через месяц после
инициирующей инъекции антигена стимулируется Т память В-лимфоцитов, которые появились
изначально. Иммунный ответ поддерживается несколько месяцев. Следует подчеркнуть, что
для индукции иммунного ответа требуется небольшое количество антигена. Также для
образования антител на малую молекулу (<1000 Д), называемую гаптеном, нужно в первую
очередь присоединить иммуногенную молекулу. Для иммунологических методов идеально
использовать кроличьи поликлональные антитела. Ограничение состоит в небольшом
количестве сыворотки крови, получаемой от одного кролика. Есть проблема с
воспроизводимостью результатов. Каждая антисыворотка должна быть тщательно
охарактеризованной. Проблема разных антисывороток может быть разрешена использованием
мышиных моноклональных антител. Мышь инъецируется конъюгатом гаптен-носитель для
стимуляции секреции антител, как и в случае с кроликом. Затем изолируются лимфоциты из
селезенки, где они обычно накапливаются, которые сливаются с клетками мышиной миеломы,
в норме не производящими антитела. Гибридные клетки (гибридома) имеют иммортализованные
свойства и могут секретировать антитела. Из одной мыши обычно изолируют до 10-ти
клонов. Так как клетки иммортализованные, они могут производить антитела в большом
количестве.
Иммунологические методы. Впервые были разработаны в 1960-х годах и
названы радиоиммунологическими. Обычно метод зависит от способности антител формировать
иммунопреципитаты с антигеном. При подходящих концентрациях молекула дивалентного IgG
может образовывать комплексы с антигеном. Если последний радиоактивно пометить,
радиоактивный преципитат можно получить центрифугированием. Однако, добавление
немеченного гаптена (моно- или поливалентного) интерферирует со связавшимся меченым
антигеном. Тогда радиоактивность в пробе падает. Строится кривая зависимости
радиоактивного сигнала в преципитате от количества немеченного гаптена. Аналогично и
для нижеописанного метода ELISA эта кривая может быть использована для измерения
количества гаптен-подобного вещества.
Для удобства метода были использованы различные подходы. Две инновации привели к
популяризации метода Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA), где используется
окраска вместо радиоактивности. В этом методе конъюгат гаптен-носитель прикрепляется
напрямую в лунки, число которых на полистиреновом плато достигает 96. Полистирен
обладает свойством необратимо связывать белки. Таким образом, перед дальнейшим
проведением методики полистирен необходимо заблокировать другими белками, например,
нежирным сухим молоком для предотвращения связывания антител с этим материалом. Затем
антитела смешиваются с различным количеством гаптена (для построения стандартной
кривой) или с неизвестным антигеном и добавляются в лунки. Антитела, которые не
связывают добавленный гаптен или неизвестное вещество, будут связываться с конъюгатом,
прикрепленным к стенке лунки. Лунки промываются и к ним присоединяются вторичные
антитела против первичных антител. Обычно первые получают из кролика, а вторые из
других животных, например, козла. К вторичным антителам пришивается фермент, обычно
щелочная фосфатаза, которая позволяет провести цветную реакцию. Альтернативно могут
использоваться конъюгаты биотин- и анавидин-щелочная фосфатаза. После этого лунки опять
промываются, и добавляется субстрат для развития окраски. Наиболее популярным
субстратом для щелочной фосфатазы является нитрофенилфосфат, который после удаления
фосфата из бесцветного превращается в желто окрашенный. Такой подход имеет два
преимущества. Первое, конъюгат с вторичными антителами удобен для использования
широкого спектра первичных антител. Второе, кроличьи антитела проявляют большое число
эпитопов. Таким образом, большое количество вторичных антител козла будет связываться с
первичными антителами. Это позволяет амплифицировать ответ в 5-10 раз, что увеличивает
чувствительность метода. Можно также повысить специфичность метода подбором
моноклональных антител. При интерпретации результатов важна специфичность ELISA метода.
Например, этот метод позволяет измерить вещество, но не его метаболиты. В некоторых
случаях это преимущество, а в некоторых - наоборот. Этот метод используется для
измерения гербицида атразина у рабочих железной дороги и может служить своеобразным
уроком. Неожиданно образцы мочи, проанализированные ELISA, дали 10 000-кратное
превышение по сравнению с традиционными аналитическими методами. Оказалось, что в моче
этот гербицид присутствует в виде меркаптурата, который измеряется данным методом с
гораздо большой чувствительностью, чем исходный образец и не выявляется традиционными
методами. Специфичность может быть также проблематичной, если чужеродные агенты
интерферируют. Например, образец, содержащий сульфуроновую кислоту, может давать
ложноположительный результат в ELISA из-за нарушения буферной емкости, так как при
низком рН нарушается связывание антител с твердым носителем. Таким образом, всегда надо
учитывать возможные факторы, влияющие на вышеописанные реакции. Чувствительность
методов ELISA была успешно разработана для выявления токсинов в водорослях, что
позволило анализировать пищу человека. Так, бреветоксин, нейротоксичный для человека яд
моллюска, имеет три формы. Все они распознаются антителами, и иммунохимический метод в
этом случае совпадает с традиционными аналитическими. С другой стороны, паралитический
яд моллюсков сакситоксин состоит из 21 производных, которые варьируют по токсичности в
пределах 1000 раз. В этом случае ELISA не может быть надежным методом для
предотвращения токсического действия ядов.
Методы связывания рецептора (Receptor Binding Assays).
Многие токсины водорослей проявляют свою биологическую активность в организме человека,
связываясь с белками-рецепторами обычно через ионные каналы. Для выявления
биологической активности одним из подходов является измерение канал-связывающих
возможностей экстрактов моллюсков. Метод концептуально схож с ELISA и развивался с
использованием мембранной фракции клеток, содержащей нужные каналы. Радиоактивный
сакситоксин (или тетрадотоксин), например, связывались с фрагментами мембраны,
содержащих натриевые каналы, необходимые для проведения нервного импульса. Экстракты
молллюсков предотвращали это связывание, причем эта величина зависела от количества
производных сакситоксина. Этот подход в настоящее время используется для молекулярного
клонирования определенных каналов. Хотя такой подход в лучшей степени, чем
иммунологические методы, измеряет биологическую активность, соответствие между
связыванием с каналом и нейротоксичностью не совершенно. Агенты, которые связываются с
каналом, могут повреждать его функцию с различной степенью. Для лучшего измерения
используются клеточные линии с каналами, имеющими определенные рецепторы; параллельно
проводятся эксперименты по определению экспрессии маркерных генов. Для увеличения
чувствительности и простоты метода используются регуляторные области ДНК гена, который
отвечает на действие токсина. К этой регуляторной области присоединяется репортерный
ген, кодирующих белок, который можно легко детектировать. Обычно используются щелочная
фосфатаза, люцифераза или зеленый флюоресцирующий белок. Такой подход можно также
использовать для определения концентрации токсина. Клеточные линии, в
которых «лигандированный» рецептор связывается с элементами генов люциферазы или
зеленого флюоресцирующего белка, весьма полезны для проведения анализа в образцах
окружающей среды.
Назад
Далее
Сайт управляется системой
uCoz