1.2 II-я фаза метаболизма ксенобиотиков
Ко второй фазе биотрансформации ксенобиотиков (II фаза) относятся реакции
глюкуронидации, сульфатирования, ацетилирования, метилирования, конъюгации с
глютатионом (синтез меркаптуровой кислоты) и конъюгация с аминокислотами, такими как
глицин, таурин, глутаминовая кислота. Кофакторы этих реакций реагируют с
функциональными ферментами 1-й фазы. За исключением метилирования и ацетилирования,
реакции 2-й фазы приводят к значительному увеличению гидрофильности ксенобиотика, что
способствует их экскреции из организма. Большинство ферментов 2-й фазы локализовано в
цитозоле, кроме уридиндифосфоглюкуронозилтрансфераз (УДТ), которые являются
микросомальными. Реакции 2-й фазы обычно протекают намного быстрее, чем реакции 1-й
фазы, катализируемые цитохромом Р-450. Поэтому скорость элиминирования ксенобиотика в
большой степени зависит от скорости, с которой протекает реакция 1-й фазы.
1.2.1. Уридин дифосфатглюкуронозил трансферазы (УДT)
Глюкуронидация является основным путем биотрансформации ксенобиотиков у многих
видов млекопитающих за исключением семейства кошачьих. Типичная реакция представлена на
рис.7. В качестве кофактора эта реакция требует присутствия уридиндифосфоглюкуроновой
кислоты (УДФ-глюкуроновая кислота). УДT локализуется в эндоплазматическом ретикулуме
клеток печени и других тканей (почки, тонкий кишечник, селезенка, кожа, мозг и т.д.).
Сайтом глюкуронидации обычно является электрон-богатый нуклеофильный атом кислорода,
азота или серы. Субстраты для УДТ содержат такие функциональные группы как
карбоксигруппу, спиртовую или фенольную (в результате реакции формируется О-
глюкуроновый эфир), первичные или вторичные аминогруппы (N-глюкурониды) или свободную
сульфгидрильную группу (S-глюкурониды). Субстратами для УДТ могут служить эндогенные
соединения, типа билирубина, стероидных и тиреоидных гормонов. Глюкуроновые конъюгаты
являются полярными соединениями, которые легко экскретируются с мочой или желчью, что
зависит от размера агликона. Например, у крыс глюкурониды экскретируются с мочой, если
молекулярная масса агликона менее 250 Да и с желчью, – если более 350 Да. Кофактор
синтезируется из глюкозо-1-фосфата и глюкуроновой кислоты и имеет -конфигурацию, что
защищает его от гидролиза -глюкуронидазами. В ходе нуклеофильной атаки на электрон-
богатый атом кислорода, азота или серы происходит инверсия конфигурации, и разовавшиеся
метаболиты имеют -конфигурацию.
C-конец всех УДT содержит мембранно-связанный домен, который выполняет функцию
якоря, закрепляя фермент в эндоплазматическом ретикулуме. Поскольку фермент обращен в
сторону просвета эндоплазматического ретикулума, а синтез УДФ-глюкуроновой кислоты
происходит в цитоплазме, то возникает проблема транспорта кофактора через
эндоплазматический ретикулум. Постулируется, что транспорт УДФ-глюкуроновой кислоты в
просвет ЭПР и УДФ в цитозоль происходит по челночному механизму. Глюкуронидация
ксенобиотиков печеночными микросомами может быть стимулирована детергентами, которые
разрывают липидный бислой, что обеспечивает УДT свободный доступ к УДФ-глюкуроновой
кислоте. Однако, высокая концентрация детергента может ингибировать УДT, разрушая
взаимодействия между ферментом и фосфолипидами. Недоступность кофактора может
ограничить скорость глюкуронидации лекарств, назначаемых в высоких дозах.
УДТ экспрессируется двумя генными семействами, УДT1 и УДT2, имеющими менее 50%
гомологии аминокислотной последовательности. Ферменты, принадлежащие к 1-му семейству,
участвуют в конъюгации фенолов, ариламинов, включая некоторые канцерогены, лекарств
типа ацетаминофена, и билирубина, а ферменты 2-го семейства – стероидов. Члены 1-го
семейства формируются путем альтернативного сплайсинга единственного гена. Множество
ферментов, представляющих собой продукт УДT1-локуса, конструируются путем соединения
отдельных субстрат-связывающих сайтов (кодируемых множественными копиями 1-го экзона),
расположенных в N-концевой части, размером примерно в 280 аминокислотных остатков, с
константной частью фермента, кодируемой экзонами 2-5. Константная область кодирует С-
концевую часть в 245 аминокислотных остатков, которая отвечает за связывание кофактора
и размещение в мембране. Таким образом, мутация в константной области может привести к
синтезу абнормальных форм всех УДТ, кодируемых локусом 1. Например, показано, что у
крыс Gunn мутация кодона 415 локуса 1 может приводить к преждевременному появлению стоп-
сигнала. При этом синтезируются укороченные и функционально неактивные формы УДТ.
Известно, что у крыс локус 1 кодирует УДT, индуцируемую 3-метилхолантреном и ТХДД.
УДT1А6 включается в конъюгацию ПАУ, ацетаминофена и ариламинов. В экстрапеченочных
тканях обнаружена конститутивная экспрессия этого фермента. Регуляция активности этого
фермента может осуществляться, по крайней мере, двумя способами, включая
тканеспецифичную и AhR-контролируемую экспрессию. В регуляторной области 1А6 обнаружен
XRE, который связывается с AhR и Arnt–белками.
Члены 2-го семейства кодируются двумя отдельными генами, причем 2А
экспрессируется в кожном эпителии, а 2В – в микросомах печени. Субстратами для них
являются стероидные гормоны. Кроме того, показано, что УДТ 2В семейства могут
участвовать в метаболизме ряда ксенобиотиков, включая морфий, а также метаболитов
канцерогенов, 2-ацетиламинофлуорена и бенз[а]пирена. У крыс 2 фермента из семейства 2В
индуцируются ФБ.
Глюкуронидация обычно представляет собой детоксикационный процесс, однако
стероидные гормоны, которые взаимодействуют с глюкуронидом по Д-кольцу (но не по А-)
могут приводить к возникновению холестазии. Индукция УДT может влиять на возникновение
рака щитовидной железы у грызунов. В некоторых случаях глюкуронидация может усилить
токсичность ксенобиотика. Например, ароматические амины типа 2-аминонафталена и 4-
аминобифенила N-гидроксилируются в печени с последующей N-глюкуронидацией N-гидрокси
метаболита. N-глюкурониды подвергаются почечной фильтрации, накапливаясь в полости
мочевого пузыря, где при кислых значениях рН происходит их гидролиз до соответствующих
канцерогенных N-гидроксиариламинов. В таком случае усиление глюкуронизации может
способствовать возникновению рака мочевого пузыря.
1.2.2. Глютатион-S-трансферазы (ГSТ)
Глютатион (ГSH) представляет собой трипептид, состоящий из глицина, цистеина и
глутаминовой кислоты, которая связана с цистеином через -карбоксильную группу. В
результате нуклеофильной атаки глютатион тиолат аниона на электрофильный атом углерода,
кислорода, азота или серы ксенобиотика, формируется тиоэфир.
Конъюгация ксенобиотиков с глютатионом катализируется суперсемейством глютатион-S-
трансфераз (ГSТ). Эти белки
обнаружены в большинстве тканей, а именно в печени, почках, тонком кишечнике, легких и
т.д. 95% от общего содержания фермента локализовано в цитоплазме и около 5% - в
эндоплазматическом ретикулуме. Субстратами для ГSТ обычно являются гидрофобные
соединения, содержащие электрофильный атом способные реагировать с глютатионом
неферментативно. На рис. 8 представлена типичная реакция, катализируемая ГST. Однако,
из-за стереоселективности реакций с ксенобиотиками, в основном они протекают при
участии ГST. Механизм, с помощью которого ГST усиливает скорость конъюгации, состоит в
депротонировании ГSH до ГS- . В этой реакции принимает участие тирозинат Tyr-O- ,
расположенный в активном центре. Субстраты для глютатионовой конъюгации можно разделить
на две группы: 1) достаточно электрофильные для осуществления прямой конъюгации, 2)
требующие активации до реакции конъюгации. 2-я группа соединений включает в себя
оксиарены, эпоксиды алкенов, ионы нитрония, ионы карбония и свободные радикалы. ГST
представляет собой димер, составленный из комбинации 2-х идентичных или неидентичных
субъединиц. Описаны следующие генные семейства ГST, кодирующие цитозольные ферменты:
alpha, mu, theta, pi, zeta. Классификация построена на основе структурных,
иммунологических и функциональных свойств. Показано, что ГST, принадлежащие к различным
классам, могут обладать перекрывающейся субстратной специфичностью. Субъединицы,
принадлежащие к различным классам, имеют менее 50% гомологии аминокислотной
последовательности. Субъединицы в пределах одного класса имеют около 70% гомологии.
Гедеродимеры могут формироваться только при участии субъединиц, принадлежащих к одному
классу. Семейства цитозольных ГST имеют общее эволюционное происхождение, причем
предковый ген наиболее близок к -классу. Микросомальные формы фермента возникли из
отдельной эволюционной ветви.
ГST представлены суперсемейством мультифункциональных изоферментов, которые
способствуют процессам детоксикации, используя различные механизмы, включая 1)
каталитическую инактивацию широкого спектра ксенобиотиков через конъюгацию с ГSH; 2)
некаталитическое связывание определенных ксенобиотиков; 3) восстановление липид- и ДНК-
гидропероксидов через экспрессию активности ГSH-пероксидазы 2.
ГST играют важную роль в детоксикации Афлатоксин В1-8,9-эпоксида. Показано, что
у грызунов отсутствие фермента, отвечающего за катализ этой реакции, связано с
повышенной чувствительностью к раку печени. Интенсивно изучается метаболизм известного
ПАУ – бенз[а]пирена (БП). Показано, что ГST печени человека обладают каталитической
активностью по отношению к реактивному метаболиту БП – БП-4,5-оксиду. Это соединение
дает позитивный ответ в тесте на мутагенность, хотя и не вовлекается напрямую в
канцерогенез. Кроме метаболизма канцерогенов, ГST детоксицирует широкий спектр других
ксенобиотиков, например фосфорорганические инсектициды, гербициды, пестициды,
химиотерапевтические лекарства. Дополнительно к защитным свойствам, ГST участвует в
биосинтезе биологически активных молекул, включая лейкотриены и простагландины.
1.2.3. N-ацетилтрансферазы
N-ацетилирование – основной путь биотрансформации для ароматических аминов или
ксенобиотиков, в том числе и лекарств, содержащих гидразогруппу (R-NH-NH2), которые
превращаются в ароматические амиды (R-NH-COCH3) или гидразиды (R-NH-NH-COCH3),
соответственно. Первичные алифатические амины редко подвергаются N-ацетилированию за
исключением цистеиновых конъюгатов, образующихся из глютатионовых, которые, в свою
очередь, путем N-ацетилирования в почках превращаются в меркаптуровую кислоту. Многие N-
ацетилированные метаболиты менее, чем исходные соединения, растворимы в воде. Однако в
отдельных случаях, например, для изониазида, N-ацетилирование облегчает экскрецию
метаболитов с мочой.
Реакция N-ацетилирования катализируется ферментами, называемыми N-
ацетилтрансферазы (NAT) и требует присутствия ацетил-кофермента А (Ац-КоА) в качестве
кофактора. Реакция протекает в два последовательных шага. Первым этапом ацетильная
группа Ац-КоА переносится к цистеиновому остатку внутри активного центра фермента с
высвобождением кофермента А:
E-SH + КoA-COCH3 →E-S-COCH3 + КoA-SH
Вторым шагом ацетильная группа Ац-КоА переносится с ацетилированного фермента
на аминогруппу субстрата. Для сильноосновных аминов скорость N-ацетилирования
определяется первым шагом , тогда как для слабоосновных – вторым. В определенных
случаях NAT могут катализировать реакцию О-ацетилирования.
NAT – цитозольные ферменты, которые были найдены в печени и многих других
тканях у большинства видов млекопитающих, за исключением лис и собак, неспособных к N-
ацетилированию ксенобиотиков.
У кроликов, мышей экспрессируется две формы NAT, обозначаемых NAT1 и NAT2. По
последним данным у человека идентифицировано, кроме этих двух классов, еще 3 класса
ферментов: арилалкин-N-ацетилтрансфераза (AANAT), L1-протеин-регулятор адгезии клеток
(L1 CAM) и гомолог Saccharomyces cerevisiae N- ацетилтрансферазы у человека (ARD1).
NAT1 и NAT2 являются близкими по первичной структуре (79-95% гомологии
аминокислотной последовательности, в зависимости от вида). У всех белков в активном
центре присутствует цистеин (Cys68). Оба белка кодируются генами, не содержащими
интронов. Гены NAT хотя и расположены на одной хромосоме, но регулируются независимо
друг от друга. NAT1 экспрессируется в большинстве тканей организма, тогда как NAT2, по-
видимому, только в печени и кишечнике. Эти ферменты отличаются по субстратной
специфичности, хотя и имеется перекрывание. Субстратами, предпочтительно N-
ацетилируемыми человеческой NAT1, являются парааминосалициловая кислота,
парааминобензойная кислота, сульфаметоксазол. Субстраты, преимущественно N-цетилируемые
при участии NAT2, включают изониазид, гидралазин, сульфаметазин, дапсон. Некоторые
ксенобиотики, например, 2-аминофлуорен одинаково хорошо метаболизируются обоими
ферментами.
Генетический полиморфизм N-ацетилирования показан у хомяков, мышей, кроликов.
Вариации в NAT2-локусе отвечают за классический полиморфизм ацетилирования,
подразделяющий индивидуумов на «быстрых», «средних» и «медленных» ацетиляторов.
Определенные вариации NAT1-локуса приводят к усилению активностей N-, О- или N,О-
ацетилирования по сравнению с диким типом. Серия клинических наблюдений, проведенных в
50-х годах, установила существование так называемых ««медленных»» ацетиляторов
антитуберкулезного лекарства изониазида. Встречаемость этого фенотипа довольно высокая
на Среднем Востоке (около 70% в Египте и Саудовской Аравии), средняя в Европе, на
Кавказе, в Америке и Австралии (около 50%), низкая в азиатской популяции (менее 25% в
Китае, Японии, Корее). В настоящее время варианты по статусу ацетилирования описаны и у
человека и у животных. Фенотип медленного ацетилирования возникает в результате мутаций
NAT2 гена, которые приводят либо к снижению активности фермента, либо к снижению его
стабильности. Например, точковая мутация в 341 нуклеотиде приводит к аминокислотной
замене Ile114 - Thr и снижает максимальную скорость N-ацетилирования (Vmax) без
изменения Кm для связывания субстрата или стабильности фермента. Эта мутация часто
встречается среди кавказской популяции, но редко среди азиатской. Внутри фенотипа
медленного ацетилирования существуют значительные вариации в скорости ацетилирования
ксенобиотиков, поскольку различные мутации оказывают различное действие на активность
и/или стабильность NAT2. У «медленных» ацетиляторов значительным оказывается N-
ацетилирование “NАT2-субстратов” при помощи NAT1.
Генетический полиморфизм NAT2 оказывает токсикологическое и фармакологическое
влияние на метаболизм лекарств, которые N-ацетилируются этим ферментом. Например,
фармакологический эффект антигипотензивного лекарства гидралазина является более
продолжительным у «медленных» ацетиляторов, тогда как медленные ацетиляторы
предрасположены к различным лекарственным отравлениям. «Медленные» ацетиляторы, которые
к тому же дефицитны по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе, особенно склонны к гемолизу под
действием определенных сульфонамидов. «Быстрые» ацетиляторы предрасположены к
миелотоксическим эффектам амонафидов, поскольку N-ацетилирование замедляет выведение
этих антинеопластических лекарств.
1.2.4. Сульфотрансферазы
Многие ксенобиотики, подвергающиеся О-глюкуронидации, подвергаются и сульфатной
конъюгации. Сульфатные конъюгаты представляют собой хорошо водорастворимые эфиры серной
кислоты. Реакция катализируется сульфотрансферазами, группой ферментов обнаруженных в
печени, почках, кишечнике, легких, мозге. Кофактором реакции служит 3’-фосфоаденозин-5’-
фосфосульфат (PAPS), который в организме синтезируется из АТФ и неорганического
сульфата.
Сульфатная конъюгация алифатических спиртов и фенолов протекает по следующей схеме:
R-OH + фосфоаденозин-ОРО2 SO4 --> ROSO3- + фосфоаденозин-О-РО32- + Н+
Сульфатная конъюгация включает перенос SO3- от PAPS к ксенобиотикам. Субстраты для
реакции не ограничиваются спиртами и фенолами, которые часто являются продуктами
реакции 1-й фазы. К ксенобиотикам, не требующим предварительной активации ферментами 1-
й фазы относятся первичные и вторичные спирты, желчные кислоты, катехолы, определенные
ароматические амины, например, анилин и 2-аминонафтален, конъюгирующие с PAPS с
образованием соответствующих сульфаматов. N-гидроксиариламины также являются
субстратами для сульфотрансфераз. Во всех случаях реакция включает нуклеофильную атаку
атомов кислорода или азота на атом серы в PAPS с расщеплением фосфосульфатной связи.
Сульфатные конъюгаты ксенобиотиков экскретируются в основном с мочой. Метаболиты,
экскретируемые с желчью могут быть гидролизованы арилсульфатазами, присутствующими в
микрофлоре кишечника, что способствует энтеропеченочной циркуляции ксенобиотика.
Сульфатазы присутствуют и в эндоплазматическом ретикулуме и в лизосомах, где
преимущественно гидролизуют сульфаты эндогенных соединений. Некоторые сульфатные
конъюгаты подвергаются дальнейшей биотрансформации. Например, андростен 3,17-диол-3,17-
дисульфат далее 15-гидроксилируется с участием цитохрома Р450 2С12, специфичного для
самок крыс фермента. Сульфатирование благоприятствует дейодированию тироксина и
трийодтирозина и может определять скорость элиминирования тиреоидных гормонов.
Относительно низкая концентрация PAPS в клетке (около 75мкМ, для сравнения –
концентрация УДФ-глюкуроновой кислоты составляет около 350мкМ) ограничивает возможности
сульфатирования ксенобиотиков. В целом этот путь биотрансформации представляется
высокоспецифичным, но низкоемким. Ряд соединений одновременно являются субстратами и
для сульфотрансфераз и для УДФ-глюкуронозилтрансфераз, при этом выбор пути метаболизма
может зависеть от концентрации субстрата, доступности кофакторов и т.д. Например,
относительное содержание продуктов метаболизма ацетаминофена зависит от дозы препарата:
при низких дозах преобладают сульфатные конъюгаты, а с увеличением дозы происходит
насыщение метаболического пути и, возможно, за счет ингибирования активности
сульфотрансфераз, снижение относительного количества сульфатных конъюгатов по сравнению
с глюкуроновыми.
Обнаружены множественные формы сульфотрансфераз, которые являются членами
одного суперсемейства. Суперсемейство подразделяется на ряд подсемейств: 1А, 1В, 1С,
1Е, 2А, 2В и 3А исходя из гомологии аминокислотной последовательности. Номенклатура
индивидуальных форм ферментов не разработана окончательно, поэтому иногда
сульфотрансферазы подразделяют на 5 классов исходя из субстратной специфичности:
арилсульфотрансферазы - сульфатируют большое количество фенольных ксенобиотиков;
алкогольсульфотрансферазы - метаболизируют первичные и вторичные спирты, включая
неароматические гидроксистероиды; эстрогенсульфотрансфераза – ароматические
гидрооксистероиды; тирозинсульфотрансфераза – тирозин метиловые эфиры, желчные кислоты.
У человека в цитозоле печени обнаружено 3 вида сульфотрансфераз: два изофермента
фенольной сульфотрансферазы и одна стероид/желчная сульфотрансфераза, называемая также
дегидроэпиандростерон-сульфотрансфераза (DHEA-ST). Фенольные сульфотрансферазы
отличаются по термостабильности – одна из форм является термостабильной, а вторая –
термолабильной. Исследование роли сульфотранфераз в биоактивации 4-аминобифенила
показало, что N-OH-аминобифенилсульфотрансферазная активность в печени и кишечнике
коррелировала с активностью термостабильной ST, но не с активностями термолабильной ST
или DHEA-ST.
Используя арилсульфотрансферазную пробу мРНК (HAST1), была продемонстрирована
заметная сульфотрансферазная экспрессия в толстом и тонком кишечнике, легком, желудке и
печени человека.
В целом, сульфатирование эффективно снижает фармакологическую и оксикологическую
активность ксенобиотиков. Однако в некоторых случаях сульфатирование увеличивает
токсичность чужеродных соединений, поскольку отдельные сульфатные конъюгаты химически
нестабильны и деградируют, формируя сильные электрофильные соединения. Сульфоконъюгация
является необходимым этапом активации многих проканцерогенов, таких как
ацетиламинофлуорен, ариламины, эстрадиол и др. Многие N-гидроксиариламины и
гидроксамовые кислоты обладали мутагенным эффектом в присутствии сульфотрансферазной
активности. Для детектирования мутагенного эффекта важно, что сульфатирование имеет
место внутри клеток-мишеней, поскольку сульфатные конъюгаты из-за своего заряда не
могут проникнуть сквозь клеточные мембраны.
1.2.5. Эпоксидгидролаза
Эти ферменты катализируют трансформацию многих реактивных и специфических
эпоксидов в дигидродиолы, которые для многих соединений являются неактивными. Но в
некоторых случаях, например, для ПАУ, образуются особо опасные эпоксид-дигидродиолы.
Гидролазная реакция (рис. 9) трансформирует эпоксид в диол. Фермент катализирует
нуклеофильную атаку водой или ОН- с противоположной стороны эпоксидного кольца.
Рис. 9. Реакция, катализируемая микросомальной эпоксидгидролазой
Образующиеся диолы имеют транс-конфигурацию. Фермента много в почках и печени.
Извесно 5 форм эпоксидгидролазы: холестериновая, лейкотриеновая, гепоксилиновая,
микросомальная и растворимая. Две последние участвуют в метаболизме ксенобиотиков.
Микросомальная эпоксидгидролаза гидрирует монозамещенные, 1,1-дизамещенные и цис-1,2-
дизамещенные эпоксиды и эпоксиды на циклических системах. Она инактивирует эпоксиды
после ферментов 1-й фазы. Водорастворимая эпоксидгидролаза гидрирует широкий спектр
эпоксидов, но не циклические системы.
Назад
Далее
Сайт управляется системой
uCoz